本文是一篇水稻的蛋白质组学文章，作者希望通过比较富硒和非富硒水稻的蛋白表达差异研究关键的基因与通路。

    这项工作被指定为使用相对和绝对定量（iTRAQ）蛋白质组学方法的等压标签研究天然富硒和非富硒水稻中蛋白质差异表达的方法。提取的蛋白质经过酶消化，脱盐，并通过iTRAQ结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术进行鉴定。进行高pHC18分离分析，然后通过ProteinPilotTM（V4.5）搜索引擎分析数据。通过比较相对定量的蛋白质来搜索蛋白质差异表达。使用基因本体论（GO），直系同源蛋白质簇（COG）和《京都议定书》的基因和基因组百科全书（KEGG）代谢途径进行了分析。总共检测到3235个蛋白质，定量了3161个蛋白质，其中401个是差异蛋白质。揭示了208个下调蛋白和193个上调蛋白。筛选出77个靶向的显着差异表达蛋白进行进一步分析，并将其分为10类：氧化还原酶，转移酶，异构酶，热休克蛋白，裂解酶，水解酶，连接酶，合成酶，微管蛋白和肌动蛋白。结果表明，天然富硒稻的抗逆，抗氧化，活性氧代谢，碳水化合物和氨基酸代谢均高于非硒稻。发现在非富硒水稻中淀粉合成途径的激活是丰富的。半胱氨酸合酶（CYS）和甲基转移酶（metE）可能是引起氨基酸差异的两个关键蛋白。OsAPx02，CatC，riPHGPX，HSP70和HSP90可能是调节两种水稻抗氧化和抗应激作用差异的关键酶。这项研究提供了有关富硒和非富硒水稻中蛋白质机制和次生代谢产物偏差的基本信息。

    前言

    硒对植物的生长发育有许多影响。它调节光合作用，呼吸作用，增强抗逆性并减轻自由基的破坏，同时还减轻了重金属的毒性作用。世界上约有一半人口食用大米（OryzasativaL.）作为主食。因此，通过育种使其生物强化是一个长期且相对无风险的过程。水稻基因组的测序和研究比其他农作物更多。此外，水稻中富硒的分子机制尚不清楚。

    用于相对定量和绝对定量（iTRAQ）技术的等压标记是一种通过串联质谱法在定量蛋白质组学中用于确定来自不同来源的蛋白质量的等压标记方法。它使用稳定的同位素标记分子对样品蛋白质或肽片段进行准确的定性鉴定和定量分析。它可以对不同样品中蛋白质的绝对或相对含量进行比较，以鉴定差异蛋白质和功能。

    在该实验中，使用iTRAQ蛋白质组学方法研究了蛋白质和代谢组水平下富硒和富硒天然水稻中蛋白质的差异表达。基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）代谢途径用于分析与水稻生物学相关的差异蛋白谱和信号传导途径。这些蛋白质的功能注释和表征将提供基本信息，并有助于详细研究硒反应机制。通过生物信息学分析和验证所确定的信号通路，将为进一步研究富硒水稻的抗氧化和抗衰老机制提供基础。

    方法

    蛋白质鉴定与生物信息学分析

    采用了基于质谱的蛋白质组学鉴定的基本过程。通过系列优化液相色谱-串联质谱数据，然后将其与数据库进行比较以对蛋白质评分以进行蛋白质鉴定。使用ProteinpilotTMV4.5在水稻转录组数据库中搜索肽段的MS/MS数据。独特肽段显示蛋白质组独特肽段序列的数量。仅考虑具有至少一个独特肽且未使用值大于1.3的蛋白质进行进一步分析，并对其进行t检验。当差异为1.5倍或更大时（即，上调≥1.5，下调≤0.67），则被视为差异显着的蛋白质（p值≤0.05）。注释功能用于执行差异蛋白的基因功能聚类（GO分析）。京都百科全书的基因和基因组途径数据库用于分析涉及差异蛋白的代谢途径。所识别蛋白质的物理，化学性质和分布用Excel图形表示。

    结果

    质谱鉴定结果

    通过ProteinpilotTM软件（V4.5，Boston，MA，USA）在水稻转录组数据库中搜索质谱数据。鉴定出3235种蛋白质的总谱，报告可信度超过95％。其中，定量了3161种蛋白质，进一步由401种差异表达蛋白质组成。特异显着差异表达蛋白质分析揭示了富硒水稻中大量下调的修饰蛋白质（208个）和非硒水稻中大量上调的修饰蛋白质（193个）。蛋白质的分子量范围为8.2kDa至611.3kDa，等电点范围为3.18至12.77，疏水性范围为-2.01至1.29，如图1所示。当疏水性数据>0时，越大值，亲水性越强。相比之下，当数据＜0时，发现该值越小，疏水作用越强。（注：定量的蛋白质数量、分子量范围、等电点范围和疏水性范围等基本信息）

    图1鉴定蛋白质的蛋白质质量分布，等电点分布和疏水性分析。

    蛋白质的功能注释

    对鉴定出的蛋白质进行GO，KEGG和COG注释，以全面反映这些蛋白质在各种生命活动中的生物学功能和意义。从富硒和非富硒水稻中获得的所有蛋白质的功能注释显示总共3235种差异蛋白质。其中，3122种蛋白质被细分为53种具有层次结构的GO分类（图2）。COG分类发现R类（仅用于一般功能预测）显着富集并包含452种蛋白质（图2和3）。通过KEGG鉴定出的差异代谢途径中有1599种蛋白质被细分为116种分类（图2）。（将筛选出的差异蛋白在GO、KEGG和COG进行功能注释）

    图2不同功能注释的统计结果。x轴表示已识别或不同的注释数据库，y轴表示蛋白质数量。

    图3S727和S3057DEP的直系同源群（COG）功能分类直方图。x轴表示不同的分类组，y轴表示每个COG类中的蛋白质数量。

    基因本体（GO）注释

    基因本体是一种全面的方法，它可以指示生物中基因和基因产物的特性。为了得到详细的描述，GO被进一步分为三个组成部分。例如，生物过程，细胞成分和分子功能。富硒和非富硒水稻之间的生物过程相关GO术语揭示了401个差异表达的蛋白质，主要参与28种不同功能。富硒和非富硒水稻的GO差异分析表明，与上调基因相比，下调基因的数量更多。

    图4S727和S3057之间的差异表达蛋白（DEP）的基因本体（GO）分类。

    直系同源群分析

    直系同源蛋白质簇是用于直系同源蛋白质分类的数据库。我们将识别出的差异蛋白与COG数据库进行了比较，以预测这些蛋白的可能功能，然后对其进行功能分类统计（图3）。排在前5位的COG类别最高的是：R，O，J，G和C。推论每个类别的功能是：一般功能预测（16.91％）；蛋白质转化，翻译修饰，伴侣蛋白（12.76％）;参与翻译，核糖体结构和生物发生（8.8％）；碳水化合物运输和代谢（8.7％）；以及能源的产生和转化（8％）。结果表明，差异表达的蛋白质参与翻译后修饰，碳水化合物和核糖体运输。他们还在某种程度上参与了能量生产和氨基酸运输。

    代谢途径注释

    不同的蛋白质在体内彼此协调以表达其生物学行为。因此，基于途径的注释拓宽了对其生物学功能的进一步了解。KEGG是一个主要的公共途径相关数据库（http://www.genome.jp/kegg/）。途径分析可以确定蛋白质调节的重要生化途径，代谢途径和信号传导途径。KEGG数据库的结果表明，差异蛋白总共参与了90条信号通路（表4）。前10个代谢途径是淀粉和蔗糖代谢途径（9.03％），糖酵解和糖异生途径（9.03％），内质网蛋白加工途径（6.94％），核糖体代谢（6.6％），光合生物炭固定途径（5.21％），果糖和甘露糖代谢（4.86％），半乳糖代谢（4.17％），氨基酸，核苷酸葡萄糖代谢（4.17％），嘌呤代谢（4.17％）和丙酮酸代谢（4.17％）。表4给出了表达的蛋白质数量和途径ID。

    表4差异表达蛋白的途径富集分析。

    差异表达蛋白（DEP）的功能注释

    正如GO所披露的，某些途径的上调和下调的DEP之间的差异令人着迷，如图5所示。发现诸如“细胞外区域部分”，“病毒繁殖”和“核酸结合转录因子活性”等途径仅在非富硒水稻中表达。硒反应性差异表达蛋白主要与多种细胞功能有关，这些功能与细胞过程，细胞和细胞部分的主要成分，离子结合和催化活性有关（图5）。

    图5S727和S3057之间的DEP的基因本体分类。

    可以在图6中看到标注到S727和S3057的前10个DEP的KEGG功能途径统计饼图。从结果可以看出，富硒和不富硒的前10个功能途径的表达是不同的白饭。从GO，KEGG注释分析可以明显看出，代谢途径是401种差异蛋白中含量最高的途径。尽管在两个水稻组中最常见的途径是代谢途径，但富含硒的水稻（73％）中该途径并发的趋势似乎最为明显。在前10条带注释的途径中有6种相同的功能，但是在两种水稻类型中，这些途径富硒和非富硒大米分别占比是不同的。水稻中对硒有响应的DEPs的表达更多。因此，富硒水稻似乎比非富硒水稻具有更好的分子功能和调控作用。

    图6《京都议定书》的基因和基因组百科全书（KEGG）途径的统计数据；S727（上调的蛋白）和S3057（下调的蛋白）中的DEP。

    筛查蛋白质信息

    最后，根据表达水平，分子功能和代谢途径筛选出77种靶向差异蛋白（图7）。根据它们作为氧化还原酶，转移酶，异构酶，热休克蛋白，裂解酶，水解酶，连接酶，合成酶，微管蛋白和肌动蛋白的功能将它们进一步分类。每个类别的比较表明，对于大多数类别，富硒水稻中表达的蛋白质数量更多。非富硒水稻中水解酶和连接酶的蛋白质数量更多。两种水稻中表达的裂解酶功能蛋白相同。

    图7S727和S3057中十种显着差异表达的蛋白质。

    讨论

    富硒和非富硒水稻的比较注释分析结果表明，蛋白质组表达水平存在显着差异。一系列生物信息学分析指出了401种差异蛋白的存在。其中77种靶向差异蛋白根据其功能分为10组：氧化还原酶，转移酶，异构酶，热休克蛋白，裂解酶，水解酶，连接酶，合成酶，微管蛋白和肌动蛋白。表5中进一步讨论了功能分布。

    表5S727和S3057中差异显着表达的蛋白质。

    这项研究为不同水稻基因型之间的次生代谢差异提供了基础数据，并在蛋白质水平上发现了重要信息，可用于进一步研究富硒食品。

    结论

    基于iTRAQ技术对水稻进行了定量蛋白质组学研究，以发现蛋白质组差异表达水平上天然富硒水稻和非富硒水稻之间的差异。差异蛋白质的生物信息学分析表明，天然富硒水稻的抗应激，抗氧化，活性氧代谢，碳水化合物和氨基酸代谢均优于非富硒水稻。但是，在非富硒水稻中淀粉合成途径明显更多。这项研究为富硒和非富硒水稻中的蛋白质组分析和蛋白质差异表达提供了有趣的见解。在自然界中，硒是许多生物和代谢过程的主要贡献者，并具有清除作用。然而，目前的研究培育了我们对该微量元素功能的理解，并揭示了硒的蛋白质机制。 

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